বিংশ শতাব্দীর প্রথম দিকে বিজ্ঞানীদের ধারণা ছিল সালোকসংশ্লেষণ প্রক্রিয়ায় নির্গত O2 এর উৎস হলো কার্বন ডাই অক্সাইড। বর্তমানে প্রমাণিত হয়েছে যে, সালোকসংশ্লেষণ প্রক্রিয়ায় নির্গত O2 এর উৎস হলো পানি।
১। ভ্যান নেইল-এর পরীক্ষা (Van Niel, 1935)ঃ বিজ্ঞানী ভ্যান নেইল সালফার ব্যাকটেরিয়ার সালোকসংশ্লেষণ পর্যবেক্ষণ করেন। সালফার ব্যাকটেরিয়া সালোকসংশ্লেষণ প্রক্রিয়ায় পানির (H2O) পরিবর্তে হাইড্রোজেন সালফাইড (H2S) ব্যবহার করেন। অর্থাৎ সালফার ব্যাকটেরিয়া CO2 ও H2S ব্যবহার করে শর্করা উৎপন্ন করে। H2O ব্যবহার না করায় O2 উৎপন্ন হয় না।
২। হিল বিক্রিয়া (Hill reaction)ঃ ব্রিটিশ প্রাণরসায়ন বিজ্ঞানী রবিন হিল (1937) একটি পাত্রে ক্লোরোপ্লাস্ট, পানি (H2O) ও হাইড্রোজেন গ্রাহক (2A) নেন। এরপর পরীক্ষণটি কিছু সময় আলোতে রেখে দেন। পর্যবেক্ষণ করে দেখতে পান H2 ও O2 উৎপন্ন হয়েছে। H2O ব্যবহার না করায় শর্করা উৎপন্ন হয় নাই, কিন্তু CO2 ব্যবহার করায় O2 উৎপন্ন হয়েছে।
2H2O + 2A → 2AH2 + O2
৩। রুবেন ক্যামেনের তেজস্ক্রিয় অক্সিজেন পরীক্ষাঃ ১৯৪১ সালে মার্কিন যুক্তরাষ্ট্রের ক্যালিফোর্নিয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের রুবেন, ক্যামেন ও র্যানডল সালোকসংশ্লেষণে তেজস্ক্রিয় অক্সিজেন (18O2) ব্যবহার করে প্রমাণ করেন যে, সালোকসংশ্লেষণ প্রক্রিয়ায় নির্গত O2 এর উৎস হলো পানি। তাঁরা পানির 18O2 তেজস্ক্রিয় আইসোটোপ চিহ্নিত করে Chlorella শৈবালের সালোকসংশ্লেষণ পর্যবেক্ষণ করেন। দেখতে পান নির্গত অক্সিজেন তেজস্ক্রিয় আইসোটোপ যুক্ত (H218O)।
6CO2+12H218O→ C6H12O6+6H2O+618O2
আবার, CO2 এর অক্সিজেনকে 18O2 তেজস্ক্রিয় আইসোটোপ চিহ্নিত করে Chlorella শৈবালের সালোকসংশ্লেষণ পর্যবেক্ষণ করেন। তাঁরা দেখতে পান, শর্করার অক্সিজেন তেজস্ক্রিয় আইসোটোপ যুক্ত (C6H1218O6)। নির্গত অক্সিজেনে তেজস্ক্রিয় আইসোটোপ নাই।
6C18O2 +12H2O→ C6H1218O6+6H2O+6O2
পরীক্ষা গুলো থেকে সুস্পষ্ট প্রমাণিত হয় যে, সালোকসংশ্লেষণ প্রক্রিয়ায় নির্গত O2-এর উৎস পানি।